厦门大学宋彦龄团队：结合代谢标记和非功能表位杂交链扩增实现外泌体特定蛋白糖基化的信号放大及功能探索

近年来，外泌体的生物功能及其在疾病诊疗中的应用价值不断被揭示。研究表明外泌体糖蛋白在跨膜信号传递、免疫抑制、肿瘤转移等众多生物过程中发挥着重要调节作用，因此对于外泌体特定蛋白的糖基化检测有助于深入理解其作用机制。目前外泌体蛋白糖基化的检测方法主要包括质谱、液相色谱和凝集素微阵列等，但这些方法普遍需要复杂的样品前处理并破坏外泌体完整性，因此难以实现生理状态下的外泌体特定蛋白糖基化检测和功能探究。

代谢聚糖标记(MGL)策略利用细胞对非天然糖的摄取，实现细胞膜/外泌体膜上聚糖的叠氮标记，并可通过叠氮和炔烃的环加成反应将特定化学基团偶联到外泌体膜聚糖上。MGL策略可保证外泌体的完整性，适用于外泌体糖蛋白的功能研究，但仅依靠MGL策略难以实现对特定蛋白的选择性标记。

厦门大学宋彦龄教授团队利用代谢聚糖标记和非功能表位适体诱导的杂交链扩增开发了一种邻近双标记策略，实现了外泌体特定蛋白糖基化的原位信号放大及功能探索。该研究以在免疫逃避中发挥关键作用的外泌体程序性死亡配体1(exoPD-L1)的糖基化作为模型。首先通过细胞代谢聚糖标记得到带有叠氮标记的外泌体（图1a），然后通过生物正交反应将一段带有二苯并环辛炔的DNA链（DBCO-T1）标记外泌体糖蛋白（图1b）；同时，PD-L1的适体延长链（Aptamer-T2）能够特异识别PD-L1蛋白的非功能表位（图1c）；在连接链（Connector）作用下，诱导DBCO-T1和Aptamer-T2序列靠近并形成一段可以打开荧光标记的H1发夹结构的DNA序列，并进一步触发H1和H2探针发生杂交链反应（HCR）（图1d），实现外泌体PD-L1蛋白糖基化信号的原位放大。由于HCR反应从PD-L1非功能表位起始，并获得具有较强刚性的双链产物，保证了PD-L1上PD-1结合区域的暴露，因此该方法不仅能实现外泌体PD-L1糖基化高灵敏成像，而且可进一步应用于其功能探究。

图1  结合代谢聚糖标记和非功能表位适体诱导的杂交链扩增的外泌体PD-L1糖基化检测示意图

实验结果表明，通过MGL和适体识别邻位诱导引发HCR，实现了对外泌体PD-L1糖基化的高灵敏检测，比无HCR扩增的信号增强了7.7倍。同时，该方法证实了PD-1阳性细胞上外泌体结合数目与exoPD-L1糖基化呈正相关，提示exoPD-L1糖基化程度与PD-1阳性免疫细胞识别相关。该方法优势在于HCR是一种无酶信号放大手段，适用于生物体，而且HCR的产物从蛋白的非功能表位进行扩增，所以对exoPD-L1和细胞的天然结合影响较小；此外，通过替换适体及代谢标记类型，该方法可拓展至外泌体其他糖蛋白功能研究。

该成果以“Amplified visualization and function exploration of exosomal protein-specific glycosylation using hybridization chain reaction from non-functional epitope”为题，最新在线发表于Science China Chemistry上（doi:10.1007/s11426-022-1240-5）。

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通讯作者简介

宋彦龄，厦门大学化学化工学院化学生物学系教授，博士生导师。2010年和2016年于厦门大学分别获得学士和博士学位，博士毕业后相继在福州大学和上海交通大学从事科研工作，2019年加入厦门大学化学化工学院。近年来一直从事微流控亲和分离研究，通过仿生识别、DNA纳米技术、界面组装和流体调控等多方面的交叉研究，提升微流控亲和界面识别动力学和热力学性质，优化靶标传质速率，实现外周血中微量循环肿瘤细胞的高效捕获、外泌体溯源及其生物功能探究。